Современная среда обитания содержит большое число факторов различной природы, вызывающих мутационные повреждения, которые играют ведущую роль в возникновении и поддержании уровней наследственных болезней, врожденных уродств и злокачественных новообразований [1,2].
Поиск и изучение антимутагенов природного происхождения являются базовыми исследованиями для разработки средств, потенциально способных защитить геном человека от негативного влияния средовых генотоксикантов [3, 4].
К настоящему моменту в экспериментах на млекопитающих установлены антимутагенные свойства ряда витаминов и микроэлементов[3,5], бета-каротина [6, 7], растительных пигментов[3,8,9,10], убихинонов [3,11] и ряда других соединений[3,12] и поставлены задачи по изучению влияния на индуцированный мутагенез комбинаций антимутагенов в составе природных комплексов, насыщенных биологически активными веществами [3,13]. Это привлекло внимание к изучению влияния на индуцированный мутагенез биологически активной добавки «Липидовит», производимой из биомассы гриба Blakeslea trispora, в которой наряду с убихиноном и бета-каротином представлен комплекс других биологически активных веществ [14,15].
Таким образом, целью настоящей работы явилось изучение антимутагенности липидовита в экспериментах на мышах, получавших химические мутагены диоксидин и циклофосфамид, а также сравнительный анализ полученных данных с результатами, выявленными ранее при изучении антимутагенной активности убихинона и бета-каротина.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на самцах мышей линии С57Bl/6 в возрасте 8-12 недель, массой 18-22 г (питомник РАМН «Столбовая» РАМН). Мыши содержались в условиях вивария НИИ фармакологии РАМН при 12-ти часовом световом режиме, свободном доступе к воде и пище.
Для индукции хромосомных повреждений использовали диоксидин («Фармакон», С-Петербург) (ДН) в дозе 200 мг/кг или циклофосфамид (ФРГ) (ЦФ) в дозе 20 мг/кг. Указанные мутагены вводили внутрибрюшинно.
Липидовит (ЛТ), полный состав которого представлен в таблице 1.1 Его вводили в оливковом масле перорально в дозах 5.4, 54 и 270 мг/кг, что в пересчете на содержание бета-каротина составило 0.15, 1.5 и 7.5 мг/кг. Выбор доз ЛТ основывали на данных предшествующих работ, посвященных изучению антимутагенных свойств бета-каротина и убихинона-10 [3,6,11].
Эксперимент проводили при введении ЛТ в трех разных режимах. В первом случае животные получали мутаген и ЛТ однократно (острый эксперимент). Во втором - мутаген применяли однократно на фоне пятидневной предобработки животных ЛТ (предобработка). В третьем – мутаген и ЛТ вводили совместно в течение 5 дней (совместное введение). Во всех вариантах эксперимента забой животных осуществляли через 24 часа после последней инъекции.
Цитогенетическое обследование проводили с помощью метода учета хромосомных повреждений в клетках костного мозга мышей [16]. При микроскопическом анализе учитывали одиночные и парные фрагменты хромосом, обмены, ахроматические пробелы хромосом (гепы) и клетки с множественными хромосомными повреждениями (более 5-ти хромосомных аберраций в клетке). Статистический анализ проводили в соответствии с - критерием при сравнении долей аномальных клеток в контрольной и экспериментальной группах. Каждая экспериментальная группа включала 4-5 мышей, от каждого животного было получено и проанализировано по 100 метафазных пластинок.
Результаты и обсуждение.
В табл. 1 представлены результаты, характеризующие влияние ЛТ на цитогенетические эффекты ДН.
ДН в разных вариантах эксперимента индуцировал хромосомные повреждения в 9,5 - 10,3 % обследованных клеток. Оливковое масло, использованное в контроле не оказывало значимого влияния на проявление цитогенетических эффектов ДН .
ЛТ, вводимый однократно в дозе 270 мг/кг, статистически значимо уменьшал цитогенетический эффект диоксидина на 38 %. В меньших дозах ЛТ не оказывал существенного влияния на проявление цитогенетической активности мутагена.
В значительно большей степени антимутагенное действие ЛТ по отношению к эффектам ДН было выражено в экспериментах с предобработкой животных. ЛТ во всем диапазоне исследованных дозировок вызывал статистически значимое снижение цитогенетического действия ДН на 59 – 69 %.
Наличие высокой антимутагенной активности ЛТ подтвердилось в эксперименте, предусматривающем его совместное пятидневное введение с мутагеном. В этом случае, ЛТ во всем диапазоне исследованных дозировок статистически значимо подавлял мутагенный эффект ДН более, чем на 50 %.
Таким образом, ЛТ обладал выраженной антимутагенной активностью в отношении цитогенетической активности ДН. Защитный эффект ЛТ значительно более выражен в условиях его повторных введений животным. В условиях острого эксперимента антимутагенные свойства ЛТ проявляются только при его введении в максимальной из использованных доз.
В табл. 2 представлены результаты, характеризующие влияние ЛТ на цитогенетические эффекты ЦФ. Отдельно взятый мутаген вызывал статистически достоверное увеличение выхода клеток с хромосомными повреждениями во всех вариантах эксперимента. Введение в контрольных сериях экспериментов оливкового масла не вызывало значимого влияния на проявление цитогенетической активности мутагена.
В условиях острого эксперимента ЛТ не оказал значимого эффекта на проявление цитогенетической активности ЦФ. Однако, в экспериментах, предусматривающих предварительное введение ЛТ его антимутагенная активность была хорошо выражена во всем диапазоне исследованных дозировок, статистически значимое уменьшение цитогенетического эффекта ЦФ составило 35- 45 %.
Способность ЛТ уменьшать мутагенное действие ЦФ была подтверждена при их совместном введении. В этом случае статистически значимое уменьшение цитогенетического действия ЦФ на % было отмечено при использовании ЛТ в дозах 54 и 270 мг/кг. В наименьшей из использованных дозировок ЛТ не влиял на проявление эффектов ЦФ.
Полученные результаты позволяют указать на наличие у ЛТ антимутагенного действия по отношению к цитогенетическим эффектам ЦФ. Антимутагенный эффект наиболее хорошо выражен в условиях предварительного введения ЛТ, но не проявляется при однократном введении.
Выше приведенные результаты с высокой надежностью позволяют указать на наличие у ЛТ антимутагенной активности в отношении двух избранных мутагенов – ДН и ЦФ. Указанные вещества различаются по механизмам повреждающего действия. ДН является прямым мутагеном, индуцирующим окислительный стресс, циклофосфамид – непрямой мутаген, генотоксический механизм которого включает алкилирующее и прооксидантное действие. Повреждающее действие большинства средовых мутагенов осуществляется по указанным механизмам [3]. Это позволяет ожидать, что антимутагенное действие ЛТ окажется достаточно универсальным и будет реализовываться в отношении широкого круга генотоксикантов.
Анализ приведенных результатов обращает внимание на две особенности антимутагенного действия ЛТ, с одной стороны, отсутствие выраженных дозовых зависимостей антимутагенного действия и, с другой – зависимость проявления антимутагенного эффекта от режима введения ЛТ. Совершенно очевидно, что его антимутагенное действие проявляется в большей степени в экспериментах, предусматривающих повторные введения. Отмеченные особенности антимутагенного действия характерны для многих жирорастворимых антимутагенов, в частности, убихинонов и каротиноидов[3,6,11]. Скорее всего, они связаны с особенностями кинетики и обмена этих естественных метаболитов организма[3].
Защитное антимутагенное действие ЛТ может быть объяснено наличием в его составе каротиноидов и убихинонов. В пользу этого свидетельствует, во-первых, практическое совпадение дозировок, в которых они вводились в составе ЛТ, и использовались в экспериментах, в которых были установлены антимутагенные эффекты отдельно взятых бета-каротина и убихинона против ЦФ и ДН [3,6,11]. Например, расчетные дозы бета-каротина в настоящем исследовании составили 0.15, 1.5 и 7.5 мг/кг тогда, как в цитированных исследованиях 0.15, 1.5, 15 мг/кг. Во вторых, совпадение особенностей проявления эффектов ЛТ и бета-каротина, оба наиболее активны в условиях повторного введения.
По эффективности антимутагенного действия ЛТ несколько превосходит бета-каротин, максимальный эффект последнего не превышает 50 % защиты, а чаще лежит в районе 30 %. Большая антимутагенная активность ЛТ может быть связана с присутствием в его составе наряду с бета-каротином антимутагенного убихинона и возможно других, еще не идентифицированных антимутагенов.
Особо следует отметить. Что ни в одном варианте проведенного эксперимента не было выявлено усиления эффекта мутагенов под действием ЛТ, что позволяет отрицать наличие у него нежелательной комутагенной активности, которая характерна для многих антимутагенов и препятствует их внедрению в качестве средств защиты генома [3,17].
Выявление способности ЛТ ингибировать цитогенетические эффекты двух химических мутагенов различного типа действия при отсутствии комутагенных эффектов открывает перспективу его возможного практического применения для увеличения устойчивости человека к повреждающему действию средовых мутагенов.
Список литературы.
1. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. // Наследственность человека и мутагены внешней среды./ М.: “Медицина”.-1989.- 270 стр
4. Ferguson L.R.//Antimutagens as cancer chemopreventive agents in the diet./ Mutat. Res.,1994, 307, 395-410.
5. M. Fenech a, L. R. Ferguson //Vitamins/minerals and genomic stability in humans./ Mutation Research 475 (2001) 1–6
6. Дурнев А.Д., Л.С Тюрина. , А.В. Орещенко, Н.В. Гусева, С.Б Середенин // Влияние пищевых каротиноидных красителей Е160а и Е160е на кластогенную активность циклофосфамида и диоксидина у мышей./ Вестник РАМН, 1997, № 7, стр. 36-39.
7. Salvadori D.M., Ribeiro L.R., Oliveira M.D.//Beta-carotene as a modulator of chromosomal aberrations induced in mouse bone marrow cells./Environ.Mol.Mutagen.-1992.-20.-206-210.
9. Dauer A., Metzner P., Schimmer O.// Proanthocyanidins from the bark of Hamamelis virginiana exhibit antimutagenic properties against nitroaromatic compounds./ Planta Med. ,1998, 64, 324-327.
10. Deguchi T., Yoshimoto M., Ohba R., Ueda S.// Antimutagenicity of the purple pigment, hordeumin, from uncooked barley bran-fermented broth./ Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000, 64, 414-416.
11. Георгиев В.Н., А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Убихиноны и антимутагенная защита организма./ Вопр. мед.химии, 1994, т.40, N 5, стр. 8-9.
12. Засухина Г.Д.//Проблемы практического использования антимутагенов./В сб.: “Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека”, часть 2, Москва.-1994.-192-214.
13. Edenharder R., Frangart J., Hager M., Hofmann P., Rauscher R.// Protective effects of fruits and vegetables against in vivo clastogenicity of cyclophosphamide or benzo[a]pyrene in mice./ Food and Chem. Toxicol., 1998, v. 36, 637-645.
15. Авчиев М.И., И.А. Буторова, П.Б. Авчиева// Изучение особенностей роста и накопления ликопина парой гетероциклического гриба Blakeslea trispora ВСБ-130(+) и ВСБ-129(-)./ Биотехнология, 2003, № 3, 12-19.
16. Preston R.J., Dean B.J., Galloway S. et al// Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells./ Mutat.Res. -1987.-189.- 157-165.
17. Zeiger E.// Illusions of safety: antimutagens can be mutagens, and anticarcinogens can be carcinogens./ Mutat Res., 2003;543, 191-194.
Методом учета хромосомных повреждений в клетках костного мозга мышей в экспериментах с химическими мутагенами диоксидином и циклофосфамидом установлены антимутагенные свойства липидовита, применяемого в дозах 5.4. 54 и 270 мг/кг перорально. Проявление антимутагенной активности липидовита зависело от режима введения и наилучшим образом проявлялось при пятидневной предобработке животных или совместном пятидневном введении с мутагенами. При однократном введении липидовит был практически не эффективен. Не выявлено комутагенной активности липидовита.
Таблица 1.1. Фракционный состав липидов гриба Bl. trispora, в % от суммы липидов /14/.
Состав жирных кислот, выделенных из биомассы гриба Bl. trispora, % отн.
Таблица 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛИПИДОВИТА НА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ДИОКСИДИНА У МЫШЕЙ
Таблица 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛИПИДОВИТА НА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЦИКЛОФОСФАМИДА У МЫШЕЙ